Secuenciación de amplicones por metodología Sanger


-  La purificación del producto de PCR, o clon de bacterias, no puede realizarse con protocolos antiguos que involucren el uso de PEG porque se tapan los capilares del secuenciador. Lo ideal es que la purificación sea con kits comercial.

- Si fuese secuenciación directa de producto de PCR, el IMIPP no se hace responsable si
hubiese lecturas de secuencias superpuestas.

- La capacidad máxima del secuenciador es de ~700pb

- Como ejemplo suponemos una situación común, que sería un producto de PCR entre 100 y 200 pb. Remitir 10 ul del ADN a secuenciar en concentración 20 ng/ul por cada reacción. Si se pretende secuenciar en sentido fwd y rev, entonces 20 ul con concentración 20 ng/ul.
Para otros casos guiarse por la tabla

- Los primers para secuenciar serán remitidos en tubo separado y en concentración 5 uM. Calcular 5 ul de primer 5uM por cada reacción de secuenciación. Temperatura de melting entre 50°C – 58°C

- Todos los tubos deben estar correctamente rotulados, con leyendas legibles y que se correspondan con lo que dice la planilla ya que ese es el nombre que tendrán las secuencias.

- Enviar la planilla con todos los datos completos. Una vez enviada aguardar la confirmación del servicio

- Coordinar vía mail previo envío de muestras.

- A fin de maximizar el rendimiento de los reactivos, la largada del secuenciador se realiza en conjunto con otros servicios de nuestra Institución 1 vez por semana.

- Sólo se recibirán hasta 48 reacciones en múltiplos de 8.

- Se devolverán los archivos .ab1 al mail de contacto.

- Una vez entregado los resultados de la secuenciación, en caso de que haya un restante de material, el mismo será conservado durante 30 días quedando a disposición para su retiro. De lo contrario, concluido este plazo el material será descartado.

Contacto: imipp@conicet.gov.ar