Tesis defendidas

En Argentina, la primoinfección por el virus de Epstein Barr (EBV) ocurre de forma asintomática y a edades tempranas. El sistema inmune del hospedador juega un rol clave en el control del virus y la expresión de sus antígenos. El objetivo de esta tesis fue caracterizar la respuesta LT CD4+ en amígdalas de pacientes pediátricos en diferentes estadios de infección para dilucidar su potencial rol en el control de la expresión de proteínas oncogénicas y su participación en la primoinfección asintomática de niños. Se analizaron 82 individuos pediátricos. En la primoinfección hubo una mayor cantidad de LT CD4+ GrzmB+. En individuos EBV+, mayor cantidad de LT CD8+ con un fenotipo de agotamiento temprano y una mayor cantidad de LT CD4+ FOXP3+. Además, se observó que varias subpoblaciones de LT CD4+ participarían en la modulación de la expresión de los antígenos de latencia LMP-1 y EBNA-2. En conclusión, la primoinfección asintomática en niños es el resultado de un delicado balance entre la regulación dada por LT CD4+ FOXP3+ y LT CD4+ GrzmB+ que actúan como un sistema complementario a los LT CD8 activados pero exhaustos. A su vez, estos linfocitos T CD4+ modularían la expresión de diferentes proteínas oncogénicas.

Este trabajo exploró la participación del virus de Epstein Barr (EBV), incluidas trazas virales detectadas por métodos de alta sensibilidad, en la patogénesis de los linfomas difusos a grandes células B (LDGCB). Se analizó la presencia de EBV por hibridación in situ (HIS) convencional y de alta sensibilidad en 62 casos de Argentina (pediátricos y adultos); además se evaluó la presencia de marcadores inmunológicos, expresión de genes de respuesta inmune y alteraciones genéticas. El 19% de los casos con más del 20% de células tumorales EBERs+ se clasificaron como LDGCB EBV+, mientras que el 33% de los considerados EBERs- mostró trazas virales por la metodología de alta sensibilidad. Exclusivamente en los LDGCB EBV+ el microambiente presentó un perfil citotóxico, pero con alta expresión de PD-L1, mientras que las trazas virales no influyeron significativamente en estos marcadores. Los LDGCB EBV+ exhibieron variaciones en determinados genes y una menor frecuencia de reordenamientos en los genes MYC, BCL2 y BCL6, lo que sugiere un mecanismo alternativo de oncogénesis mediado por el EBV. Los hallazgos de este trabajo revelaron que solo la infección activa por EBV, y no sus trazas, alterarían los mecanismos analizados, enfatizando la importancia de la detección del EBV en LDGCB.

La infección por el virus de hepatitis C (HCV) persiste como un desafío global por su impacto en salud pública dado que causa enfermedad hepática crónica severa. La coinfección con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) complica aún más el cuadro, acelerando el daño hepático a través de mecanismos patogénicos distintos. Comprender estos procesos es clave para mejorar terapias y diagnósticos no invasivos. En este contexto, el análisis de miRNAs en vesículas extracelulares (EVs) surge como una herramienta prometedora para estudiar la patogenia y desarrollar biomarcadores para un manejo clínico más preciso y personalizado. El objetivo del trabajo fue caracterizar el perfil de miRNAs en individuos con infección crónica por HCV mono- y coinfectados con HIV en distintos compartimentos, para comprender su impacto en la patogenia y su potencial rol como biomarcadores no invasivos de daño hepático. Los resultados mostraron que existen firmas de expresión de miRNAs en EVs asociadas a la condición de infección (HCV+ o HCV+/HIV+) y al estadio de fibrosis hepática (F<2 y F≥2). Estas firmas aportan información valiosa sobre los mecanismos subyacentes en la interacción virus-huésped, las vías involucradas en la progresión de la enfermedad y la identificación de biomarcadores asociados a condiciones clínicas desfavorables.

Primer estudio en una cohorte argentina que aporta evidencia epidemiológica y molecular sobre el rol del virus de Epstein-Barr en la patogenia de la esclerosis múltiple. Identificó una disminución del ARNm de IQGAP1 en linfocitos B EBV+ de pacientes, y demostró in vitro que la inhibición de Iqgap1 aumenta la proliferación de linfocitos T y B y la expresión de los factores de transcripción RORγt y T-bet, asociados a respuestas proinflamatorias.

El virus de Epstein Barr (EBV) se halla ampliamente distribuido en el mundo, es el agente etiológico de la mononucleosis infecciosa y a su vez se asocia al desarrollo de neoplasias de origen linfoide y epitelial. Existen dos tipos virales, EBV1 y EBV2, que se distinguen por su variabilidad genética y distribución geográfica. En los últimos años, con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación masiva se obtuvieron más de 1000 genomas completos de EBV aislados de diversas patologías y regiones geográficas; sin embargo, los aislamientos de América del Sur y de EBV2 han sido poco representados en estos estudios. El objetivo de esta tesis fue caracterizar la variabilidad molecular y la evolución del genoma completo del EBV en el contexto geográfico y patológico, así como evaluar su impacto sobre el reconocimiento de los epítopes virales en relación a su interacción con las poblaciones humanas en diferentes regiones geográficas. Se secuenciaron 45 genomas completos de EBV aislados de muestras de pacientes de nuestra región geográfica con patologías asociadas a este virus y con alta carga viral, y se analizaron conjuntamente con 247 genomas de EBV descargados de NCBI a partir de dos pipelines bioinformáticos propios. Tanto en el árbol filogenético como en el análisis de componentes principales se evidenció que la mayor fuente de variabilidad en los genomas de EBV está dada por los tipos virales. Los genomas de Asia y Oceanía segregaron en forma independiente a los del resto del mundo, mientras que los genomas de América del Sur segregaron junto con los africanos. Se identificaron por primera vez las posiciones que contribuyen a la diferenciación entre tipos virales y grupos geográficos. La tasa de evolución del genoma completo fue de 9,09 × 10−6 sustituciones/sitio/año, y los genes no estructurales implicados en el inmunoescape viral presentaron las mayores tasas evolutivas. Esta variabilidad, así como la mayor tasa evolutiva del genoma viral en comparación con el genoma humano, impacta sobre los epítopes virales reduciendo su afinidad por los distintos alelos de HLA que los reconocen, lo que podría ser relevante para el diseño de vacunas y tratamientos específicos basados en linfocitos T estimulados con antígenos virales.

El virus de Epstein Barr (EBV) infecta a más del 90% de la población mundial adulta. En Argentina la infección ocurre a edades tempranas y de manera subclínica. Es un virus de transmisión oral, y es en la amígdala donde encuentra su célula blanco, el linfocito B, en el cual establece una infección persistente de por vida. El sistema inmune innato podría tener un rol preponderante frente a la infección y, a largo plazo, en el desarrollo de linfomas asociados a EBV. La mayoría de los estudios describen a las células NK como las principales involucradas en prevenir el desarrollo de síntomas en niños; sin embargo, no existen demasiados estudios acerca del papel de los macrófagos. El objetivo fue determinar el rol de los macrófagos en la infección por Epstein Barr y su potencial contribución al proceso de linfomagénesis asociada al virus en pacientes pediátricos. Se estudiaron 89 pacientes pediátricos con hiperplasia amigdalina no reactiva, clasificados según el estadio de infección. Se determinó por inmunohistoquímica la expresión de proteínas de latencia y de ciclo lítico, marcadores de macrófagos (CD68, CD163, CD169) y PD-L1, y se caracterizó el microambiente amigdalino y las subpoblaciones de monocitos por citometría de flujo. En el 89% de los casos prevaleció el perfil de macrófagos M1, independientemente del subtipo o carga viral. En la primoinfección asintomática por EBV prevaleció el perfil M1 incluso en un entorno regulatorio, al cual podría atribuirse la falta de síntomas. Además, la oncoproteína viral LMP-1 promueve la generación de un microambiente regulatorio mediante la regulación positiva de receptores en macrófagos y monocitos (PD-L1, CD163, CD206).

El linfoma de Hodgkin es una neoplasia linfoide que se caracteriza por un bajo porcentaje de células tumorales (menos del 2%) inmersas en un microambiente inflamatorio. La asociación con el EBV ha sido estudiada principalmente en pacientes adultos. El objetivo fue evaluar la participación del microambiente en la patogénesis de los linfomas de Hodgkin pediátricos asociados a EBV. Se evaluaron 96 pacientes, divididos en grupo EBV+ y EBV-, así como en mayores y menores de 10 años. Se realizó hibridación in situ para EBERs y se analizaron por inmunohistoquímica los marcadores linfocitarios, macrófagos, citoquinas inmunosupresoras y las moléculas del punto de control PD-1, PD-L1 y LAG-3. Se evidenció la prevalencia de un balance entre perfil citotóxico y proinflamatorio con un perfil inmunoregulatorio, polarizado a M1, en menores de 10 años asociados a EBV, contrarrestado por un entorno regulatorio polarizado a M2 en los pacientes mayores de 10 años y no asociados a EBV. Además, en los casos EBV+ se encontró una mayor expresión de células PD-L1+ en el microambiente. En los casos EBV+ se generaría un microambiente citotóxico y proinflamatorio, contrarrestado por un microambiente regulatorio y tolerogénico, en el que la expresión de PD-L1 cumpliría un rol importante.

La infección por el virus de hepatitis B (HBV) es una de las principales causas de enfermedad hepática crónica, caracterizada por daño celular, inflamación y fibrosis de lenta evolución. La hepatitis B crónica se clasifica en estadios que reflejan la interacción entre el virus y la respuesta inmune, de cuyo balance resulta la severidad del daño hepático. La composición celular del infiltrado inflamatorio hepático determinaría la evolución tanto del proceso infectivo como del daño hepático. El objetivo fue caracterizar, en el microambiente hepático y en su reflejo periférico, los componentes inmunes y los marcadores virales en diferentes estadios de la hepatitis B crónica. En biopsias hepáticas de 35 adultos sin tratamiento se evaluó por inmunohistoquímica la frecuencia en el infiltrado de linfocitos T citotóxicos, Th, Th1, Th17 y Treg; la expresión de PD-1 y perforina; y la expresión de los antígenos de superficie (HBsAg) y core (HBcAg). Se determinó por inmunofluorescencia la distribución de los linfocitos T citotóxicos en relación con los hepatocitos HBsAg+ y HBcAg+, y en sangre periférica se evaluó por citometría la frecuencia y funcionalidad de las poblaciones celulares.

El virus de Epstein-Barr (EBV) es un miembro de la familia Herpesviridae que infecta, de forma latente y de por vida, al 90% de la población mundial. Su sitio de ingreso son las amígdalas, donde encuentra a sus células blanco, los linfocitos B. En países en vías de desarrollo la infección primaria ocurre mayoritariamente en la primera infancia de forma asintomática. Particularmente en Argentina, el 70% de los niños y niñas evaluados por nuestro grupo presentaron serología positiva para EBV en los primeros tres años de vida. El EBV posee potencial oncogénico dada la expresión de oncoproteínas mediante las cuales regula la supervivencia de los linfocitos B durante el establecimiento de la infección. Nuestro grupo de trabajo describió una asociación entre la presencia del EBV y el desarrollo de linfomas en pacientes pediátricos menores de 10 años. Las células NK cumplen funciones tanto antivirales como antitumorales, dada su capacidad de producir citoquinas como interferón gamma y de reconocer células tumorales por el mecanismo conocido como respuesta missing-self. En pacientes pediátricos de países desarrollados se demostró que las células NK cumplen un rol fundamental en la infección primaria por EBV; particularmente, se describió que la subpoblación caracterizada como CD56bright CD94+, prevaleciente en pacientes pediátricos que cursaban la primoinfección, restringe la infección viral y la transformación mediada por EBV.

La infección crónica por el virus de hepatitis C (HCV) es una de las principales causas de enfermedad hepática crónica, caracterizada por daño celular, inflamación y fibrosis que puede progresar a cirrosis y hepatocarcinoma. El objetivo del trabajo fue establecer, en el microambiente hepático y en periferia, el rol de la interacción entre el virus, las células de la respuesta inmunitaria y las citoquinas que estas producen. Se evaluaron en forma concomitante muestras de biopsia hepática y sangre periférica de 48 pacientes adultos con infección crónica por HCV. Los resultados demostraron que en la infección crónica por HCV hay un bajo porcentaje de células infectadas, sin relación con la carga viral, cuya frecuencia no se asocia a la severidad del daño hepático. En el área lobulillar se observó una elevada presencia de linfocitos T citotóxicos en contacto con los hepatocitos, con un rol dual: lograrían cierto control de la replicación viral pero favorecerían el daño del parénquima. A nivel portal predominaron los linfocitos Th, con elevadas frecuencias de Th1 y Treg. Tanto los linfocitos Th17 como la IL-8 tendrían un claro rol patogénico y participarían de forma conjunta en el desarrollo de la fibrogénesis hepática. En resumen, las poblaciones celulares de la respuesta inmunitaria, principalmente a nivel intrahepático, participan en el balance entre la promoción y la moderación de la injuria hepática.

El virus de Epstein Barr (EBV), agente etiológico de la mononucleosis infecciosa (MNI), se asocia también a neoplasias. Si bien las causas por las cuales contribuye a la linfomagénesis están aún en estudio, la identificación de variantes virales asociadas a tumores podría responder en parte este interrogante. Dado que LMP1 es la principal proteína oncogénica de EBV, el objetivo fue identificar y caracterizar las variantes moleculares en sus regiones promotora y codificante, y determinar su participación en la patogenia de las enfermedades asociadas. Se incluyeron 29 pacientes pediátricos con linfomas asociados a EBV, 30 con MNI y 14 controles con hiperplasia reactiva. Se amplificaron mediante PCR las regiones promotora ED-L1 y codificante, se secuenciaron y se realizó análisis filogenético. Se analizó además in vitro la actividad del promotor. Región ED-L1: se definieron 4 clados denominados según las líneas celulares B95.8, Cao, Raji y P3HR1. B95.8 fue el más frecuente (47%), pero no se asoció a ninguna patología en particular. Se observaron mutaciones en sitios de unión a factores de transcripción: la pérdida del C/EBP disminuye 3 veces la actividad de ED-L1. Región codificante: se identificaron 6 clados (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 y Argentina [Arg]), de los cuales prevaleció la variante de circulación local, Arg (46%), potencialmente originada por recombinación Raji/China1 y que podría tener un origen africano. No se observó una asociación entre variantes específicas y linfomagénesis, aunque algunos polimorfismos tuvieron mayor frecuencia en linfomas. Se estimó una tasa de evolución acelerada en comparación a lo esperado para un herpesvirus, quizás influenciada por la presión de selección positiva sobre codones específicos. Este análisis muestra una evolución compleja de este gen y revela la importancia de su potencial utilización como marcador de variantes virales geográficas.

Los macrófagos hepáticos desempeñan un papel central en el mantenimiento de la homeostasis tisular, y participan en la defensa frente a patógenos, la modulación de la respuesta inflamatoria y los procesos de regeneración. Su notable plasticidad les permite adaptarse a las señales del microambiente, generando estados de polarización hacia fenotipos proinflamatorios o antiinflamatorios. En la infección por el virus de hepatitis C (HCV), los macrófagos contribuyen a la respuesta antiviral inicial. Sin embargo, su papel en el establecimiento y la persistencia de la cronicidad permanece aún insuficientemente caracterizado.

El objetivo de este estudio fue evaluar el perfil pro- y antiinflamatorio de macrófagos a nivel intrahepático y periférico en individuos con hepatitis C crónica (CHC), tanto monoinfectados con HCV como coinfectados HCV/HIV, y analizar su asociación con el grado de injuria hepática para evaluar su rol en la patogenia de esta enfermedad.

Para ello, a partir de muestras de biopsias fijadas en formol e incluidas en parafina (BHFFIP) y de sangre periférica, se evaluó la expresión de CD163 y CD68 para analizar el perfil de los monocitos/macrófagos mediante inmunohistoquímica (IHQ) y RT-qPCR, respectivamente. Asimismo, se integraron con datos previamente obtenidos en el laboratorio sobre caracterización del microambiente hepático y periférico, incluyendo: i) la frecuencia de poblaciones celulares en tejido hepático (linfocitos totales, Th, CTL, B, Treg y Th17) determinada por IHQ; ii) la expresión de citoquinas en tejido hepático fresco (TNF-α, IL-23, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17A, IL-21, IL-10 y TGF-β) por RT-qPCR; iii) la frecuencia de poblaciones celulares en sangre periférica (Th, CTL, B, NK, Th1, Treg y Th17) por citometría de flujo; iv) los niveles plasmáticos de CD163 soluble (sCD163) por ELISA; y v) la cuantificación de citoquinas plasmáticas (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17A, IL-10 y TGF-β) mediante CBA o ELISA.

A nivel hepático, se observó una mayor expresión de CD68 y CD163 en individuos con CHC respecto a los controles. Además, una proporción relevante de individuos HCV+ (40,0%) y HCV+/HIV+ (36,4%) presentó un perfil opuesto al de los controles (CD68<CD163), con mayor expresión de CD68 respecto de CD163 (CD68≥CD163, predominio de CD68). En relación con la fibrosis hepática, el análisis del ratio CD68/CD163 evidenció valores más bajos en los casos con mayor severidad, lo cual indicaría mayor expresión de CD163.

A nivel periférico, no se observaron diferencias significativas en la expresión de CD68 y CD163, así como su ratio, entre los grupos ni con respecto al daño hepático. Sin embargo, los niveles plasmáticos de sCD163 fueron significativamente más elevados en individuos con CHC en comparación con los controles, con un incremento asociado a mayor severidad de la enfermedad.

Con respecto a las poblaciones celulares de la respuesta inmunológica analizadas en el microambiente hepático, los linfocitos B mostraron una tendencia a una mayor frecuencia en el grupo con predominio de CD68 (CD68≥CD163), mientras que los linfocitos Treg presentaron una tendencia en sentido opuesto, con mayor frecuencia en el grupo con predominio de CD163 (CD68<CD163). A su vez, el recuento total de linfocitos fue significativamente mayor en los casos con perfil CD68≥CD163. En cambio, en sangre periférica no se observaron diferencias significativas en ninguna de las poblaciones celulares evaluadas entre los distintos perfiles de macrófagos; no obstante, en el grupo HCV+/HIV+, los Treg demostraron mayores frecuencias en los casos con perfiles intrahepáticos con predominio de CD163 (CD68<CD163).

Con respecto a las citoquinas, si bien la mayoría mostró valores más elevados en los casos con predominio de CD68, solo las citoquinas proinflamatorias IFN-γ y TNF-α y la citoquina antiinflamatoria IL-10 alcanzaron diferencias significativas. Por otro lado, la IL-6 presentó niveles significativamente mayores en los casos con mayor severidad de fibrosis, tanto en tejido hepático como en plasma, lo que sugiere su asociación con la progresión del daño hepático.

Este estudio destaca el papel de los macrófagos en la regulación del microambiente hepático y en la patogenia de la CHC, evidenciando su participación tanto en los procesos inflamatorios como en los mecanismos de inmunorregulación y progresión del daño hepático. Asimismo, pone de manifiesto la complejidad y especificidad del compartimento hepático frente a la respuesta inmune sistémica, así como la relevancia de integrar distintos niveles de análisis para comprender la dinámica de la enfermedad.

En conjunto, estos hallazgos resaltan el potencial de los macrófagos y de mediadores asociados como posibles biomarcadores y blancos terapéuticos en la CHC.

La sífilis es una enfermedad de transmisión sexual y congénita. A pesar de las medidas de prevención y sus opciones de tratamiento relativamente económicas, esta infección tiene más de 12 millones de casos anuales a nivel mundial. El acceso al diagnóstico es crucial para el control y eliminación de sífilis en la población de nuestro país, en donde esta afección presenta un incremento acelerado en la última década.

El impacto que esta enfermedad puede adquirir en ausencia de una correcta detección y tratamiento muestra sus efectos más temidos en la transmisión transplacentaria, que conlleva una alta morbilidad en los recién nacidos. En particular, en esta población los métodos serológicos de tamizaje actuales son de bajo rendimiento; por lo que en recién nacidos expuestos el tratamiento es instaurado guiado por un diagnóstico de riesgo. Esto hace que la búsqueda de nuevos métodos diagnósticos directos sea urgente en esta población.

En el presente trabajo, y teniendo como antecedentes trabajos previos de nuestro laboratorio con la validación de PCR en Chagas, nos planteamos la utilidad de la implementación de técnicas de biología molecular en la detección directa de sífilis en la población pediátrica; para lo cual se desarrolló un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como blanco el gen TP47. La prueba demostró un adecuado desempeño con respecto al objetivo planteado en muestras de sangre e hisopado, siendo robusta, específica y con buena repetibilidad. Si bien las restricciones impuestas por la pandemia de COVID-19 limitaron este estudio y el reclutamiento de pacientes, realizamos un análisis preliminar del rendimiento de la técnica en diferentes muestras de recién nacidos con sífilis congénita y niños con sífilis adquirida por contacto no sexual y sexual.

En dicho análisis, y en comparación con los de las pruebas de serología, se obtuvo una sensibilidad variable de acuerdo al tipo de muestra (68% hisopado, 100% sangre periférica), mientras que la especificidad se mantuvo en 100%. A pesar del escaso número, el análisis de una población piloto con sífilis congénita mostró una sensibilidad del 80% y una especificidad del 100%, cercano al descrito por bibliografía. Esto reafirma la utilidad de TP47 como una alternativa diagnóstica en desarrollo y una herramienta útil para la vigilancia epidemiológica de sífilis congénita y en población pediátrica.

El diagnóstico de sífilis es complejo en pediatría: requiere el conocimiento de la epidemiología del paciente y su familia, así como el trabajo multidisciplinario con pediatras clínicos. A pesar de las limitaciones, estos resultados representan los primeros datos de la implementación de técnicas de biología molecular en la población pediátrica en nuestro país (y unos de los pocos en la región), señalando a estas técnicas como un campo promisorio para profundizar en esta enfermedad.

Estudió el patrón de expresión de survivina en el microambiente tumoral de 37 linfomas de Hodgkin pediátricos. Encontró sobreexpresión nuclear de survivina en las células tumorales que, a diferencia de lo descripto en carcinomas, no correlacionó con mayor proliferación ni mostró diferencias en la expresión de las variantes de corte y empalme. La asociación con el virus de Epstein-Barr tampoco modificó la expresión de la proteína.